白血病多药耐药机理的研究进展

1  P- 糖蛋白和 mdr1基因

    1976 年 Juliano等在研究中国仓鼠卵巢细胞（ CHO细胞）对秋水仙碱和其它作用于膜的药物的交叉耐药性时发现，具有交叉耐药性的细胞内药物积聚发生障碍，进一步研究发现这种细胞表面有 1种分子量为 170KD的糖蛋白存在，这种糖蛋白只在变异的具有交叉耐药性的 CHO细胞表面存在，而在原代 CHO细 胞表面则没有，作者将其命名为 P-糖蛋白（ P-glycopro-tein， P170），并认为这种糖蛋白可以改变细胞膜疏水区对药物的通透性（ 2）。 1986年美国国立癌症研究院发现了多药耐药基因 mdr1（ 3）。

    现在已经知道，拥有 P170的肿瘤细胞摄入药物的能力与敏感细胞没有差异，但药物外排能力却加强，表明 P170能调节细胞膜通透性以影响药物在细胞内积聚。 P170由 1280个氨基酸残基组成，其中肽链占 140KD，糖链占 30KD， P170的 N端与 C端形成对称结构，且氨基酸序列有高度同源性，每部分 各由细胞质亲水区与跨膜疏水区组成，疏水区具有通道蛋白性质，亲水区有 ATP结合位点。因此， P170被认为在 MDR细胞中充当能量依赖性药物外排泵（ 4），但其具体过程尚不清楚。

    编码 P170的是 mdr1基因，人的 mdr1基因定位在第 7号染色体长臂的第 2区第 1带上，含 28个外显子（ 5）。 1986年 Igor等用 DNA分析和 Southern杂交的方法证明其转录 4． 4kb的 mRNA片断（ 6）。 Takatori等研究发现 mdr1上游－ 131到＋ 10表现出启动子活性，并发现 3种 DNA结合蛋白，分别为 NF-R1、 NF-R2、 NF-R3，其中 NF-R2与 mdr1基因转录激活的负调控有关，能与 mdr1基因上 ATTCAGTCA序列及 GC盒结合，而 ATTCAGTCA又被认为是 mdr1基因转录的正调控区域 A（ 7）。此外，又有学者证明，在 mdr1基因上游存 在 2个特殊区域，分别在－ 258～－ 198和－ 136～－ 76，在人 KB细胞中分别与抗癌因子和热休克有关（ 8）。

    mdr1 基因及其表达产物 P170是目前研究最多的 1种多药耐药机制，逆转其作用过去曾被认为是 1把双刃剑（ 9），因为 P170在人类正常组织如肾上腺、肾脏、回结肠、直肠、肝、肺等均有较高表达，这显然与这些组织的解毒功能有关，但目前认为这种表达在耐药肿瘤细胞中更高。另外，有人在非 P-糖蛋白表达的 MDR细胞中发现了 1种由 1522个氨基酸残基组成的膜转运蛋白含量明显高于药敏细胞，并证明是 1种细胞膜 ATP结合蛋白，也参与肿瘤耐药性的形成 （ 10）。目前，将多种与 MDR有直接关系的蛋白（不包括 P170）如 190KD、 95KD、 100KD等统称为多药耐药相关蛋白（ Multidrug resistance-assoiated protein， MRP），它们对 MDR的影响正在越来越多地被观察到。

2 、 DNA拓扑异构酶 Ⅱ（ topoisomerase， TopoⅡ）

    TopoⅡ 是催化 DNA拓扑异构体相互转换的 1种酶， TopoⅡ经纯化已得到 2种有活性的同工酶，分别称做 α、 β，分子量分别为 170KD和 180KD。。以 TopoⅡ为靶点的抗肿瘤药物的作用是通过形成稳定的可切割复合物抑制 DNA的复制与转录，通过对这类药物呈现耐药性的细胞的研究发现， TopoⅡ的含量与活性有所改变，如 Perry等对丝裂霉素（抗 TopoⅡ）的耐药株和敏感株细胞的研究中发现，耐药株的 TopoⅡ活性下降（ 11）。另 外，在研究潘生丁增强阿霉素、米托蒽醌和鬼臼乙叉甙在耐药细胞 B16VDXR中的作用机制时， Damle等认为潘生丁可与 TopoⅡ相互作用，妨碍 TopoⅡ抑制剂引起的 DNA破坏的修复，增强了药物的细胞毒性（ 12）。 Fox等在研究结肠癌对米托蒽醌的耐药细胞株时，用共聚焦显微镜观察发现与米托 蒽醌相关的荧光在非耐药细胞中强于耐药细胞，且主要分布在细胞质和核周围，认为米托蒽醌很可能通过慢性 TopoⅡ俘获至 DNA损伤不能修复，导致临床上非 典型的 MDR（ 13）。

    一般说来， TopoⅡ异常所致的 MDR有以下特点： ①对许多天然药物呈现抗药性，但对长春碱类则没有； ②膜活性药物不能提高抗肿瘤药物的细胞毒作用； ③药物在细胞内聚积与保留没有变化； ④mdr1与 P170表达未见增加； ⑤TopoⅡ含量及活性均有所下降。   

3   谷胱甘肽和谷胱甘肽 S-转移酶

    化疗药物能与谷胱甘肽（ glutathione， GSH）结合而被解毒，这是在谷胱甘肽 S-转移酶（ glutathione S-transferase， GST）催化下发生的反应。 GST不仅可催化亲电物质与 GSH结合，而且 GST自身也可与亲脂性药物结合增加其水溶性，促进 外排而降低抗肿瘤药物的细胞毒作用。

    Komiya 等对耐顺铂的骨肉瘤细胞的研究中发现，细胞质内的谷胱甘肽和过氧化氢酶含量增高，但抑制过氧化氢酶后药物敏感性无明显提高，而抑制谷胱甘肽后药物敏感性提高 70％（ 14）。 Kuroda等在研究同一肿瘤患者化疗前后肿瘤细胞耐药情况时发现，化疗后株与化疗前株相比，对阿霉素的耐药性增加 3倍， 对顺铂的耐药性增加 2． 7倍，但未见 mdr1基因表达，而谷胱甘肽 S-转移酶（ GST）的水平明显升高，说明其化疗耐药性与 GST活性有关，而与 mdr1 基因无关（ 15）。在耐苯丙酸氮芥的人黑色素瘤细胞中， GST水平升高， Hansso等用 GST抑制剂 —依他尼酸，证明可以逆转对苯丙酸氮芥的耐药。 Ciaccio等也发现依他尼酸可显著增加许多 MDR细胞对烷化剂的敏感性。以上均说明 GSH和 GST在一些肿瘤多药耐药机制上起重要作用。

4   蛋白激酶（ proteinkinaseC， PKC）

    1994 年 Laredo等选用 2组不同特征的 AML细胞， 1组耐阿霉素， 1组对阿霉素敏感，他们发现对阿霉素的耐药性与 P-糖蛋白无关，而 Staurosporine（ ST）是 1种 PKC抑制剂，加入 ST可使阿霉素的细胞毒性增加 2－ 3倍，由此得出， PKC活性增强也是 1种细胞耐药的机制 （ 16）。后来发现 PKC的这种作用主要是通过使 P170磷酸化并使其功能增强而实现的， P170做为 PKC的底物，尽管数量未增加，但其药物外排功能却 增强了，从而在 P170并未过度表达时也产生耐药性。 PKC主要催化丝氨酸或苏氨酸的磷酸化，有多种同工酶，如 α、 β、 γ、 ε、 δ、 ζ等，各自具体的作用还不清楚。 CloudHeflin等选择了 KB-3（敏感株）和 KB-V1（耐药株） 2种人肿瘤细胞来研究 PKC的作用情况，用同工酶特异抗体 Immunoblotting方法，发现 KB-V1中 ε、 δ、 ζ没有变化，而 α升高，与 KB-3细胞明显不同，故认为 PKC-α在 MDR表型中起重要作用 （ 17），但这仅是对 PKC的初步了解，因其同工酶分布不同，不同的 MDR细胞中 PKC的活性变化也不一致，不同的调节因子对敏感细胞和耐药细胞可通过不 同的同工酶进行调节，并很可能出现一些交替变化的不确定机制（ 18）。

5  与致癌和抑癌基因的关系

    Correntic 等调查了 18000例乳腺癌病人，发现有多发性癌基因改变，过度表达的是 c-myc、 int-2、 neu和 c-myb，用 slotblot分析浸润癌的 mRNA，发现 30％的肿瘤同时有 mdr1和 c-myc的高水平表达（ 19）。 Norris等也从神经肉瘤细胞的耐药性研究中证实， MRP的表达与 n-myc扩增有关，有 n-myc扩增的细胞 MRP基因表达高， MRP高表达者的 5a生存率是 57％，低表达者是 94％，据此认为 MRP的表达情况有预后意义，而 mdr1和 N-myc则没有（ 20）。但上述结果却与 Khyari等的研究不一致，他的研究显示， mdr-1过度表达，伴 有细胞核内 c-myc、 c-myb表达减少，而 c-fos和 c-jun表达增加。这些说明 MDR与癌基因有关，但不同的情况下可能有不同的解释。另外， Rafki等研究发现 p53基因的表达和功能的变异与 CEM-VLB细胞的耐药性有关，在 MDR细胞中，野生型 p53受抑制，而变异的 p53可特异地激活 mdr1启动子，与此对应，当用小剂量诱导药物长春花碱作用于这些耐药细胞时， p53基因表达增高（ 21）。应用不同的细胞均证明， mdr1基因与癌基因 的活性有关，同时也与抑癌基因的丢失有关（ 22）。

6   与细胞生活环境变化的关系

6 ． 1   与 pH值的关系

    Hamilton 等通过结肠癌细胞株研究了 MDR逆转剂与细胞内 pH值的关系，在加入逆转剂的同时加入含碳酸氢盐／ CO2的林格氏缓冲液，使细胞内 pH值 逐渐降低（ 0． 1～ 0． 3units），发现细胞内酸化可以加强细胞的化学敏感性，特别在碱性的细胞外环境下，有助于减少 MDR修饰因子的效应，同样有助 于 P-糖蛋白阴性细胞的化学敏感性的提高（ 23）。 Miller等在研究正定霉素在克鲤鱼的近端肾小管的分泌情况时，发现 pH为 8． 25时，细胞内正定霉素的聚集不受环孢素 A的影响，当 pH为 7． 25时，药物在细胞内的聚集被环孢素 A所增加，其机制可能是 pH为 8． 25时药物通过简单扩散穿过管侧膜，并由 MDR传输蛋白分泌入管腔，而 pH为 7． 25时，除扩散外，还有有机阳离子载体介导的重吸收，故而分泌减少，细胞内含量增加（ 24）。现在已知 P-糖蛋白 的 ATP酶活性的最适 pH是 7． 5。