康复指导
血液系统肿瘤微小残留病灶及其检测
作者： 来源： 日期 07-09-10 11:00:11 点击数：
血液系统恶性疾病及实体肿瘤的现代化疗和造血干细胞移植治疗，使患者获得较彻底的治疗。目前临床判断缓解是根据症状、体征消失、血象正常、急性白血病骨髓细胞计数原始和幼稚细胞百分比小于5％。按照此标准确定的缓解，部分患者病情最终难免复发，说明患者体内仍存在常规显微镜不能检测到的白血病细胞或肿瘤细胞，即微小残留病（Minimal residual disease，MRD），是影响治疗效果的一个重要临床问题。MRD是指经放、化疗及造血干细胞移植等治疗，未达到清除性效果时，患者体内残留白血病细胞或肿瘤细胞的状态。就白血病患者而言，白血病细胞大量增殖蓄积，发病时体内白血病细胞数达109水平以上，经治疗可使白血病细胞数减少3～4个对数级或更低，因而体内残留的白血病细胞或肿瘤细胞负荷的范围较大，可能是接近0，也可能是109水平或为接近出现临床症状的肿瘤负荷。临界临床复发时的MRD负荷水平与临床明显白血病之间无确切界限。在目前判断标准确定的MRD范围内，常规骨髓细胞形态学及细胞遗传学方法，不能敏感地检测MRD，难以客观地对病情转归进行科学预测，使治疗上存在较大的盲目性。检测MRD的临床意义，在于指导治疗方案设计、发现耐药、评估疗效、预测复发。
一、微小残留病灶检测标志与相关技术
临床常规细胞形态学和染色体检查敏感性低，低于 1×10-3～1×10-5水平以下的残留白血病细胞，或实体肿瘤的微小转移灶及肿瘤周边组织浸润的肿瘤细胞，检测时难以鉴别单个或数个白血病细胞或异常核型。需要用更敏感的方法才能检测到。白血病及肿瘤细胞的抗原表型异常改变，如染色体易位、倒位、丢失，及基因重排、插入、缺失和所形成的融合基因等遗传变异，为检测MRD提供了可靠的标志。依据这些分子标志检测MRD敏感度达10-2～10-6，检测敏感度依次为荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）、流式细胞分析（flow cytometry，FCM）、聚合酶链反应（PCR）等，各项技术检测特异性亦各不相同。因为并不是全部的白血病或肿瘤细胞均存在同一种遗传变异，各种遗传变异也不都存在于同一种疾病中，所以需根据各种分析技术的检测敏感性及特异性，选择相关的标志，有针对性地分析。只要检测到相关标志，即是MRD存在的证据。若将各种技术联用，定性与定量分析结合，不但提高检测特异性，还可增加检测敏感性。
临床常规细胞形态学和染色体检查敏感性低，低于 1×10-3～1×10-5水平以下的残留白血病细胞，或实体肿瘤的微小转移灶及肿瘤周边组织浸润的肿瘤细胞，检测时难以鉴别单个或数个白血病细胞或异常核型。需要用更敏感的方法才能检测到。白血病及肿瘤细胞的抗原表型异常改变，如染色体易位、倒位、丢失，及基因重排、插入、缺失和所形成的融合基因等遗传变异，为检测MRD提供了可靠的标志。依据这些分子标志检测MRD敏感度达10-2～10-6，检测敏感度依次为荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）、流式细胞分析（flow cytometry，FCM）、聚合酶链反应（PCR）等，各项技术检测特异性亦各不相同。因为并不是全部的白血病或肿瘤细胞均存在同一种遗传变异，各种遗传变异也不都存在于同一种疾病中，所以需根据各种分析技术的检测敏感性及特异性，选择相关的标志，有针对性地分析。只要检测到相关标志，即是MRD存在的证据。若将各种技术联用，定性与定量分析结合，不但提高检测特异性，还可增加检测敏感性。
二、FISH技术检测MRD
FISH技术是利用已知的核酸探针，与组织、细胞及染色体标本中相关核酸序列杂交，通过间接免疫荧光反应，直接定位基因。大多数白血病及实体肿瘤细胞有染色体异常，是检测白血病细胞存在的客观标志，检测MRD的敏感度为10-2水平。被检测的标本不必经过细胞培养，分裂间期、中期及终末期细胞标本均可。还可以分析石蜡固定组织切片及瑞氏染色的标本，尤其是染色体显带不易分辨的倒位、丢失及复杂畸形染色体等。与染色体核型分析相比，分析快速、灵敏、特异，能检测较多的骨髓或外周血细胞。FISH分析染色体易位及所形成的融合基因，是根据相应探针检测细胞中显示出不同颜色的荧光信号，证明有白血病细胞或肿瘤细胞特异存在的染色体易位和融合基因，是检测MRD的标志技术。如 CML造血干细胞移植治疗后，检测到bcr/abl融合基因；AML患者化疗缓解后，在AML-M3检测到染色体t(15;17)形成的PML/RARα；在AML-M5检测到t（9；11）形成的MLL/AF9；在AML-M2检测到t(8;21)形成的AML1/ETO等融合基因，即表明残留有白血病细胞。69％～84％的ALL有染色体三倍体，75％的ALL细胞有染色体+17，作为标志能较可靠地检测MRD。治疗缓解时减少，复发时又增多，提示残留的白血病细胞增殖。FISH联用FACS检测，可能提高敏感度达10-4～10-3水平，并提高特异性。实践观察到FISH检查染色体缺失的敏感性较差，假阳性率高于检查染色体三体，不利于检测MRD。用双色或多色FISH分析同一个细胞不同的染色体异常标志，也可提高检测特异性，减少检测假阳性。影响FISH分析的主要因素有细胞标本的固定、探针的纯度、杂交反应条件及洗脱条件、杂交背景、染色体形态、荧光信号强弱等。
FISH技术是利用已知的核酸探针，与组织、细胞及染色体标本中相关核酸序列杂交，通过间接免疫荧光反应，直接定位基因。大多数白血病及实体肿瘤细胞有染色体异常，是检测白血病细胞存在的客观标志，检测MRD的敏感度为10-2水平。被检测的标本不必经过细胞培养，分裂间期、中期及终末期细胞标本均可。还可以分析石蜡固定组织切片及瑞氏染色的标本，尤其是染色体显带不易分辨的倒位、丢失及复杂畸形染色体等。与染色体核型分析相比，分析快速、灵敏、特异，能检测较多的骨髓或外周血细胞。FISH分析染色体易位及所形成的融合基因，是根据相应探针检测细胞中显示出不同颜色的荧光信号，证明有白血病细胞或肿瘤细胞特异存在的染色体易位和融合基因，是检测MRD的标志技术。如 CML造血干细胞移植治疗后，检测到bcr/abl融合基因；AML患者化疗缓解后，在AML-M3检测到染色体t(15;17)形成的PML/RARα；在AML-M5检测到t（9；11）形成的MLL/AF9；在AML-M2检测到t(8;21)形成的AML1/ETO等融合基因，即表明残留有白血病细胞。69％～84％的ALL有染色体三倍体，75％的ALL细胞有染色体+17，作为标志能较可靠地检测MRD。治疗缓解时减少，复发时又增多，提示残留的白血病细胞增殖。FISH联用FACS检测，可能提高敏感度达10-4～10-3水平，并提高特异性。实践观察到FISH检查染色体缺失的敏感性较差，假阳性率高于检查染色体三体，不利于检测MRD。用双色或多色FISH分析同一个细胞不同的染色体异常标志，也可提高检测特异性，减少检测假阳性。影响FISH分析的主要因素有细胞标本的固定、探针的纯度、杂交反应条件及洗脱条件、杂交背景、染色体形态、荧光信号强弱等。
三、FCM技术检测MRD
白血病细胞特征是恶性克隆增殖，并停留于某一分化阶段，虽然至今未发现白血病细胞有特异的抗原表型，但由于常出现抗原不同步、系性交叉、过度表达等表型。可以根据不同分化阶段中，利用相应单克隆抗体，检查细胞抗原免疫表型数量上的异常，判断是否存在白血病细胞。FCM检测MRD敏感度达10-4水平，如检测到MRD持续存在，表明无病生存时间较短，预示病情将复发。实验观察共同表达CD19及CD117抗原的正常淋巴细胞低于4×10-5，表达CD20/CD34及CD22/CD34的细胞低于5×10-4。在B-ALL中如高于这个水平，预示病情复发。多参数FCM分析CD19/CD45/CD20/CD10和CD19/CD45/CD9/CD34二组标记，提示CD19是有价值的标志，CD19大于20％，即提示MRD存在。分析CLL细胞中见CD5表达较高，而CD19表达低，据此提出CLL的“免疫学缓解标准”，如外周血细胞表达CD5、CD19与总CD19之比低于25％，骨髓细胞中低于15％为缓解。低于这个标准缓解可持续13～33个月，超过该标准多在3～6个月后复发。CML经造血干细胞移植治疗后，分析嵌合体细胞 CD13、CD14、CD20、CD3表达，其中粒系标志CD13表达水平最高，经给予供者淋巴细胞输注逐渐清除体内残留白血病细胞后，表达水平下降。
白血病细胞特征是恶性克隆增殖，并停留于某一分化阶段，虽然至今未发现白血病细胞有特异的抗原表型，但由于常出现抗原不同步、系性交叉、过度表达等表型。可以根据不同分化阶段中，利用相应单克隆抗体，检查细胞抗原免疫表型数量上的异常，判断是否存在白血病细胞。FCM检测MRD敏感度达10-4水平，如检测到MRD持续存在，表明无病生存时间较短，预示病情将复发。实验观察共同表达CD19及CD117抗原的正常淋巴细胞低于4×10-5，表达CD20/CD34及CD22/CD34的细胞低于5×10-4。在B-ALL中如高于这个水平，预示病情复发。多参数FCM分析CD19/CD45/CD20/CD10和CD19/CD45/CD9/CD34二组标记，提示CD19是有价值的标志，CD19大于20％，即提示MRD存在。分析CLL细胞中见CD5表达较高，而CD19表达低，据此提出CLL的“免疫学缓解标准”，如外周血细胞表达CD5、CD19与总CD19之比低于25％，骨髓细胞中低于15％为缓解。低于这个标准缓解可持续13～33个月，超过该标准多在3～6个月后复发。CML经造血干细胞移植治疗后，分析嵌合体细胞 CD13、CD14、CD20、CD3表达，其中粒系标志CD13表达水平最高，经给予供者淋巴细胞输注逐渐清除体内残留白血病细胞后，表达水平下降。
四、PCR技术检测MRD
以PCR为代表的分子生物学技术检测MRD得到广泛运用，其敏感性达10-6～10-5水平，结合FACS、FISH、Southern印迹、Dot杂交、序列分析等技术，既提高检测特异性，又减少假阳性和假阴性。检测白血病细胞或肿瘤细胞的分子证据，包括染色体易位形成的融合基因，如 CML中出bcr/abl、AML-M3中 PML/RARα、PLZF/RARα融合基因等。免疫球蛋白（Ig）基因和T细胞受体（TCR）基因等重排所形成的克隆特异性片段。目前，利用这些基因标志检测MRD，不仅是定性分析，而且可以进行定量检测，同时可将多个基因检测联合运用分析，具有较高敏感度和特异性，并得到临床实际应用。典型的是CML中bcr/abl融合基因，见于95％的患者。另一典型是AML-M3 中PML/RARα融合基因，见于 90％的患者。分别作为该白血病克隆的分子标志鉴定MRD。Ph+的ALL和CML进行CD34+纯化及非纯化造血干细胞移植后，分析bcr/abl融合基因，判断CD34+纯化及非纯化者供者植入率分别为30％和86％，并能可靠地检测MRD。观察自体骨髓造血干细胞移植治疗AML-M3前，检测骨髓细胞 PML/RARα融合基因为阳性，移植后转为阴性，临床缓解持续22个月后仍为阴性，PML/RARα检测阴性者将能获得长期缓解，而检测 PML/RARα阳性者，需要考虑进一步治疗。
淋巴细胞在分化过程中Ig和TCR基因各区片段重排，各片段以V-D-J形式结合，并且有随机核着酸缺失和插入，形成克隆特异性序列片段。正常情况下重排片段为多克隆性，但在淋巴细胞白血病为单克隆性。作为淋巴细胞白血病克隆特异性标志，能与多克隆的正常淋巴细胞相区别。Ig和TCR基因重排与某些遗传变异相关，T淋巴细胞白血病中染色体t(1;14)使tal-l与TCR基因并置，在伯基特淋巴瘤中t(8;14)及滤泡型淋巴瘤 t(1;18)分别使 myc及bcl-2置于Ig基因控制之下，所形成的重排片段均为肿瘤特异标志，用于定性和定量检测MRD。检测MRD的技术包括竞争定量PCR、实时定量PCR、异源双链PCR、荧光PCR等，均是比较敏感特异的方法。以PCR检测结果判断患者对治疗的反应，分为分子良好反应和分子不良反应，高于1×10-3为分子不良反应者，应改换治疗方法，而分子良好反应者可以逐渐延长治疗间期后停药。
上述各种检测MRD技术多已用于临床，检测到有相应的基因及相关标志存在，即是存在微小残留病灶的证据。在造血干细胞移植中，可以评价骨髓净化，比较各种预处理的临床效果、预测复发、判断预后等。目前已知MRD在体内可以长期存在，并随治疗及缓解的时间长短有负荷数量的变化。以目前标准定义的MRD负荷范围较大，临床观察有的患者PCR检测MRD阳性，但仍无病生存。提示MRD负荷范围可能存在最低界限，低于这个界限的患者将可能长期无病生存。因而，应长期动态定性及与定量检测，确立明确的MRD检测界限范围。目前认为对白血病患者获治疗缓解后，每3个月检查骨髓，能预测90％患者的复发倾向。定量PCR检查结果提示，持续缓解到第2年时，体内残留的白血病细胞负荷已降到最低。如果检测阴性提示残留的白血病细胞已被清除或已降到PCR检测限度以下。如出现假阴性可能是残留的白血病细胞在体内分布不均，应多个部位取标本检查。Ig和TCR基因也可能发生连续重排，即克隆演化使核昔酸序列改变，不同于病变初期时的重排序列，引物序列与之不符，而不被检测。或出现寡克隆变化，同时存在多种基因标志，难以确定特异检测标志。对此应在IgH、TCRγ、TCRδ、tal-1等重排基因中，选择2个以上基因标志同时进行分析，可以提高检测特异性。为减少假阴性及操作污染引起的假阳性，同时要设立阳性及阴性对照，并严格控制操作条件。
以PCR为代表的分子生物学技术检测MRD得到广泛运用，其敏感性达10-6～10-5水平，结合FACS、FISH、Southern印迹、Dot杂交、序列分析等技术，既提高检测特异性，又减少假阳性和假阴性。检测白血病细胞或肿瘤细胞的分子证据，包括染色体易位形成的融合基因，如 CML中出bcr/abl、AML-M3中 PML/RARα、PLZF/RARα融合基因等。免疫球蛋白（Ig）基因和T细胞受体（TCR）基因等重排所形成的克隆特异性片段。目前，利用这些基因标志检测MRD，不仅是定性分析，而且可以进行定量检测，同时可将多个基因检测联合运用分析，具有较高敏感度和特异性，并得到临床实际应用。典型的是CML中bcr/abl融合基因，见于95％的患者。另一典型是AML-M3 中PML/RARα融合基因，见于 90％的患者。分别作为该白血病克隆的分子标志鉴定MRD。Ph+的ALL和CML进行CD34+纯化及非纯化造血干细胞移植后，分析bcr/abl融合基因，判断CD34+纯化及非纯化者供者植入率分别为30％和86％，并能可靠地检测MRD。观察自体骨髓造血干细胞移植治疗AML-M3前，检测骨髓细胞 PML/RARα融合基因为阳性，移植后转为阴性，临床缓解持续22个月后仍为阴性，PML/RARα检测阴性者将能获得长期缓解，而检测 PML/RARα阳性者，需要考虑进一步治疗。
淋巴细胞在分化过程中Ig和TCR基因各区片段重排，各片段以V-D-J形式结合，并且有随机核着酸缺失和插入，形成克隆特异性序列片段。正常情况下重排片段为多克隆性，但在淋巴细胞白血病为单克隆性。作为淋巴细胞白血病克隆特异性标志，能与多克隆的正常淋巴细胞相区别。Ig和TCR基因重排与某些遗传变异相关，T淋巴细胞白血病中染色体t(1;14)使tal-l与TCR基因并置，在伯基特淋巴瘤中t(8;14)及滤泡型淋巴瘤 t(1;18)分别使 myc及bcl-2置于Ig基因控制之下，所形成的重排片段均为肿瘤特异标志，用于定性和定量检测MRD。检测MRD的技术包括竞争定量PCR、实时定量PCR、异源双链PCR、荧光PCR等，均是比较敏感特异的方法。以PCR检测结果判断患者对治疗的反应，分为分子良好反应和分子不良反应，高于1×10-3为分子不良反应者，应改换治疗方法，而分子良好反应者可以逐渐延长治疗间期后停药。
上述各种检测MRD技术多已用于临床，检测到有相应的基因及相关标志存在，即是存在微小残留病灶的证据。在造血干细胞移植中，可以评价骨髓净化，比较各种预处理的临床效果、预测复发、判断预后等。目前已知MRD在体内可以长期存在，并随治疗及缓解的时间长短有负荷数量的变化。以目前标准定义的MRD负荷范围较大，临床观察有的患者PCR检测MRD阳性，但仍无病生存。提示MRD负荷范围可能存在最低界限，低于这个界限的患者将可能长期无病生存。因而，应长期动态定性及与定量检测，确立明确的MRD检测界限范围。目前认为对白血病患者获治疗缓解后，每3个月检查骨髓，能预测90％患者的复发倾向。定量PCR检查结果提示，持续缓解到第2年时，体内残留的白血病细胞负荷已降到最低。如果检测阴性提示残留的白血病细胞已被清除或已降到PCR检测限度以下。如出现假阴性可能是残留的白血病细胞在体内分布不均，应多个部位取标本检查。Ig和TCR基因也可能发生连续重排，即克隆演化使核昔酸序列改变，不同于病变初期时的重排序列，引物序列与之不符，而不被检测。或出现寡克隆变化，同时存在多种基因标志，难以确定特异检测标志。对此应在IgH、TCRγ、TCRδ、tal-1等重排基因中，选择2个以上基因标志同时进行分析，可以提高检测特异性。为减少假阴性及操作污染引起的假阳性，同时要设立阳性及阴性对照，并严格控制操作条件。
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