树突状细胞（DC）与临床（一）

恶性血液病患者的福音——树突状细胞培养

众所周知， T 细胞介导的免疫应答在机体抗肿瘤过程中起主导作用，由于 DC 是体内抗原递呈功能最强大的抗原递呈细胞 ， 为 T 细胞的致敏、激活和扩增递呈相应的抗原多肽 ， 并提供共刺激信号。因而关于 DC 的研究已成为一大热点。由于其在体内分布广泛而含量稀少 ， 因此 ， 许多 DC 的体外培养扩增方法已经逐步完善并应用于临床。目前 ， 具有免疫刺激功能的髓系来源的 DC 可以由具有增殖能力的 CD34+ 前体细胞或由无增殖能力的 CD14+ 细胞在体外培养扩增产生。标本可来源于骨髓、脐带血或成人外周血。

体外扩增 DC有两个途径，一是在来源于骨髓或外周血的CD34造血干细胞中加入GM-CSF和TNF-α而生成；另一是人外周血的单核细胞在IL-4 和GM-CSF 两种细胞因子存在下转变而来。后一途径具有简便、获量大的优点。从外周血获得单核细胞，经 GM-CSF、IL-4 和TNF-α联合培养 7～8 天后，可生成大量形态不规则细胞表达DC的特征性表面分子 CD1a ，并高度表达 CD80、HLA-Ⅰ类、Ⅱ类HLA等表面分子，符合DC的特征。

（一） DC 的培养

1．体外培养DC的方法

取采集物单个核细胞 （ MNC）或来源于骨髓单个核细胞 的贴壁细胞部分 ， 调节细胞浓度为 2 × 10⁶/ml ～ 4 × 10⁶/ml， 用细胞因子 GM-CSF加IL-4 培养 7 ～ 14d ，每 3 ～ 4d 半量换液。待 DC 成熟后 ， 用 含 EDTA 的胰蛋白酶消化收集。

2．体外培养 DC 的生成

用 GM-CSF加IL-4 培养采集物或骨髓的 MNC 约 7 ～ 14d 。于培养 3 ～ 5d 后 ， 细胞出现小的聚集 ， 且增殖速度较快。在 7 ～ 10d 时 ， 粘附细胞团扩大 ， 有扩增趋势 ， 胞体亦变大 ， 部分细胞呈星状或毛刺状外表。至 12 ～ 14d， 松散的成熟 DC 有两种表现 ： 一种贴壁 ， 不规则 ， 伸展着粗大树根状突起 ； 另一种非贴壁 ， 呈圆形 ， 胞浆透亮 ， 外表呈细小毛刺状突起。培养 12 ～ 14d 后 ， 收集 DC， 用流式细胞仪检测其免疫表型 ， 可见 DC 显著表达 HLA-DR 、 CD1a 、 CD11c 、 CD54 、 CD80、CD83等免疫标记 。

3．体外培养DC 细胞的变化

从骨髓和外周血单个核细胞中培养的 DC细胞，细胞起始浓度一般调整为2×10⁶/ml。随着培养时间的延长，一部分细胞体积变大，形态发生树突样改变，同时细胞数量明显减少，在培养的4-5天，细胞数约为（5-6）×10⁵/ml，到第7-8天，细胞数可减至（1-4）×10⁵/ml，到培养的第14天左右，细胞数量更少。但是，大体积树突状细胞所占的比例在不断增加，能达70%-80%。

    （二）DC的分类及作用

DC是一个异质性细胞群，按来源可分为髓性DC（MDC）和淋巴细胞性DC（LDC），尽管二者形态相似，都可以激活幼稚T细胞，但它们的起源发育和表面分子不同，MDC来源于骨髓的CD34+细胞，在GM-CSF、TNF- α 和 IL-4的存在下发育成熟；LDC来源于胸腺，其发育不需要GM-CSF的参与。有人将人的MDC和LDC分别命名为DC1和DC2，当二者分别与同种T细胞培养时，DC1（MDC）诱导T细胞分泌 IFN-γ 、 IL-2，并产生Th1型应答，而DC2（LDC）诱导T细胞分泌IL-2、IL-4、IL-5和IL-10等因子，产生Th2型应答。人类DC成熟最重要的刺激信号是CD40L和CD154抗体。LDC和MDC分泌不同的细胞因子可以介导不同的细胞反应，Th1型应答引起免疫排斥，Th2型在较多的情况下参与免疫耐受。

     （三）DC的分化发育

DC的来源和分化发育所处的阶段与其功能有非常密切的关系，未成熟DC主要是摄取和加工处理抗原，成熟期DC则主要司职递呈抗原并活化初始型T细胞。来源于髓系的DC前体可发育为郎罕氏细胞，在细胞因子作用下可发育为成熟DC，也可先发育为单核细胞，再进一步发育为成熟DC。

髓系 DC的主要功能为加工处理和递呈外源性抗原；淋巴系DC主要参与中枢和外周免疫耐受。终末分化的或成熟的DC有很强的免疫激活功能；未成熟DC启动免疫功能较差，但它们专门进行摄取和提呈抗原、合成MHC-多肽复合物。未成熟DC能表达一些膜受体FcγRⅡ，人甘露糖受体，这些受体能介导其摄取抗原。成熟DC的特点是：（1）表达高水平多肽-MHC复合物；（2）表达高水平共刺激分子CD80、CD86、CD40、LFA-3/CD58、ICAM-l/CD54等；（3）能分泌IL-12，尤其是在CD40L作用下能分泌TH1型细胞因子。