白血病细胞多药耐药及其干预对策

　　 白血病耐药性是指白血病细胞对化疗药物的不敏感性，它既可以天然存在 (内源性耐药)，也可以由抗癌药物诱发(获得性耐药)。多药耐药(Multidrug resistance, MDR)是其最重要的耐药形式之一，它是白血病细胞接触一种抗癌药物后产生的对多种结构和功能迥异的抗癌药物的耐受性 [1]。白血病细胞MDR是目前白血病治疗中的一大难题，正日益受到生物医学界的高度重视。本文概述白血病MDR发生的主要机制及干预对策的研究进展。
　　 1 白血病多药耐药的发生机制
　　MDR是多因素、多种机制共同作用的结果，目前提出的MDR发生机制主要有:
　　1.1  膜糖蛋白介导的药物外排泵机制
　　研究发现，MDR的出现与肿瘤细胞内药物聚集降低有关，表明药物转运的改变(外排增加)可能是产生耐药的原因。参与药物外排机制的膜糖蛋白主要有P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)、多药耐药相关蛋白(Multidrug resistance-associated protein, MRP)、肺耐药相关蛋白(Lung resistance protein, LRP)和乳腺癌耐药蛋白(Breast cancer resistance protein, BCRP)等四种。
　　P-gp 是由MDR-1基因编码的、分子量170KD 的跨膜糖蛋白，故又称P170蛋白。它是一种能量依赖性的“药泵”，能将疏水亲脂性的药物泵出细胞外，降低白血病细胞内抗癌药物的浓度，无法构成对白血病细胞的有效杀伤而引起MDR [2]。
　　MRP与P-gp在结构和功能上有许多相似之处，也是一种依赖能量的药泵，分子量190KD。MRP 能识别和转运与谷胱甘肽(GSH)偶合的底物，故又称为GSH-X泵。在MRP介导机制中，细胞毒药物可与GSH-S-偶合物相结合形成能被MRP转运的三重复合物，导致细胞内药物积聚的减低或分布改变，有些药物局限于核周囊泡内而不能进入细胞核内，从而使药物呈房室分布 [3～5], 具体机理不详。
　　LRP是另一个与MDR相关的糖蛋白，分子量为110KD。LRP可导致细胞内药物聚集缺陷，机制尚不清楚，可能与溶酶体的药物转运有关 [1,6,8]。
　　最近发现的乳腺癌耐药蛋白(Breast cancer resistance protein, BCRP)也属于ATP依赖性的药物转运蛋白，与白血病细胞的耐药有关，约30%的AML BCRP mRNA表达增高，具体作用机制不明。
　　1.2 MDR的酶介导机制
DNA拓扑异构酶Ⅱ(TopoⅡ)、谷胱甘肽转移酶(GST)、 氧化解毒酶P450等酶系统均可能在细胞耐药的发生机制中起作用。目前研究较多的为TopoⅡ和GST。TopoⅡ是一种解旋酶，与DNA结合后解开DNA双链，产生裂解复合物。研究证明, TopoⅡ基因的点突变可改变其特定的氨基酸序列, 使TopoⅡ发生质或量的改变, 直接影响TopoⅡ与DNA的结合, 导致裂解复合物形成减少，DNA裂解抑制而导致耐药, 已经证实在某些类型的耐药细胞中TopoⅡ含量及活性下降 [7]。
　　GST是另一种与MDR相关的酶，它能催化亲电物质与其结合，并可与亲脂性细胞毒药物结合增加其水溶性，促进药物排泄而降低抗癌药物的作用，与化疗耐药有一定的关系。基因转移GST cDNA, 可提高敏感细胞对特异性药物的耐药性；细胞内GST降低或缺乏可增加阿霉素等药物的细胞毒活性。
　　1.3 凋亡调控基因介导的机制
　　近年来许多研究表明，抗肿瘤药物是细胞凋亡的诱导剂, 化疗药物的细胞毒效应可能主要是触发肿瘤细胞程序化死亡的通路, 凋亡有可能是大多数化疗药物作用的最终共同途径。从这个意义上来说，白血病细胞的耐药是细胞凋亡的抑制, 而参与细胞凋亡调控的bcl-2、P53、Ras、c-myc等基因的表达失控, 则可能导致白血病细胞对化疗药物的耐受。目前研究比较多的是bcl-2基因和P53基因。
　　1.3.1 bcl-2基因家族
　　bcl-2基因家族包括bcl-2、bcl-x、bax、bak、mcl-1和A1。bcl-2是最重要的抑制细胞凋亡的基因, 它位于18号染色体上(18q21) , 但在多数肿瘤患者中, 可发生染色体t(14;18)易位，使bcl-2 基因位于14号染色体(14q32)，接近免疫球蛋白重链的转录增强子, 导致bcl-2的高度表达。bcl-2基因的编码产物为26KD的蛋白质(P26-bcl-2), 常定位于核膜、线粒体膜和滑面内质网膜上。bcl-2基因的过度表达可以促进细胞的生存, 故bcl-2基因又称为长寿基因, 它同时也抑制射线、化疗药物等诱导的细胞凋亡，bcl-2 基因的高水平表达与多种化疗药物诱导的细胞凋亡的抑制显著相关。临床分析发现经强烈化疗的急非淋患者P26-bcl-2和/或P-gp 过度表达均能导致患者对化疗的耐受, 但两者之间无相关性 [9]。若用bcl-2基因转染bcl-2 低表达的肿瘤细胞, 被转染细胞的bcl-2表达增强，对大多数细胞毒药物产生耐受；用针对bcl-2 mRNA 的反义寡核苷酸处理ALL患者的白血病细胞，bcl-2蛋白的表达量减少, 并伴有凋亡增强和对阿糖胞苷的敏感性增加 [10]。采用bcl-2基因建立的转基因小鼠模型也证实bcl-2的高表达抑制细胞凋亡的发生；临床上许多白血病和实体肿瘤细胞中bcl-2基因的表达频度较高者, 往往同时伴有对放、化疗的耐受。
　　1.3.2 P53基因
　　P53基因编码53KD 的磷酸化蛋白质，有野生型和突变型两种存在形式。野生型的作用为诱导DNA受损伤的细胞进入G1/G0静止期, 抑制细胞增殖, 直到损伤DNA得到修复, 若修复失败, 则诱导损伤细胞凋亡。当P53基因发生缺失、突变等致表达异常时(突变型)，其对凋亡过程的调控也会发生异常；当其发生突变或表达缺乏时, 化疗药物所诱发的细胞凋亡受到抑制, 导致肿瘤细胞对化疗药物的耐受显著增强 [10,11]。同时P53基因的突变也可能特异性激活MDR-1/P-gp启动子, 使肿瘤细胞产生MDR。
　　其它参与凋亡调控的基因, 如c-myc、ras、Fas/APO-1、bcr/abl、c-erbB-2/neu 等也与肿瘤细胞耐药的发生相关联。
　　1.4 其它机制
　　细胞膜的改变影响药物的转运和外排, 细胞激素受体量和亲合力的改变等也与肿瘤细胞耐药的发生相关 [5～10]。值得指出的是, 白血病细胞耐药的发生并不是单一因素导致的, 而是由多种因素共同作用的结果, 如在某些耐药细胞中MDR-1基因和MRP基因同时过度表达、MRP基因过度表达和TopoⅡ降低同时存在等等。
　　2 干预白血病细胞耐药的策略
　　白血病细胞耐药是化疗失败的主要原因, 因此研究干预或克服白血病细胞耐药的对策是提高白血病(肿瘤)治疗效果的重要手段。综合文献及我们的研究，干预白血病细胞耐药可采取下列对策。
　　2.1 逆转策略
　　逆转白血病细胞耐药是目前研究的主攻方向, 特别是对于MDR-1/P-gp介导的经典耐药, 体外逆转的效果较好。尽管体外逆转耐药的方法很多, 但临床实用的不多, 而且效果也欠佳。白血病细胞耐药的逆转策略包括以下方面。
　　2.1.1 耐药逆转剂
　　耐药逆转剂也称为耐药调整药物(resistance modifying agents), 目前研究的种类很多, 如钙离子通道抑制剂(维拉帕米、异博定等)、环孢霉素A(CsA)及衍生物、肿瘤坏死因子(TNF), 干扰素等; 某些从中药中提取的单体物质(如粉防已甲素、汉防已甲素、补骨脂抽提物R3等)的逆转效果较好, 而且毒副作用低 [3,12]。逆转剂逆转细胞耐药的可能机制为: ①与化疗药物竞争性结合P-gp的结合位点, 使抗癌药物与P-gp的结合减少, 抑制药物外排, 增加细胞内药物浓度; ② 抑制MDR-1基因的表达, 或直接抑制P-gp的合成，降低P-gp的含量。
　　2.1.2 免疫治疗
　　2.1.2.1 特异性抗体: 抗P-gp、MRP和LRP的单克隆抗体, 可与相应的跨膜糖蛋白药泵特异结合而封闭其功能, 抑制化疗药物与药泵结合以减少胞内药物外排 [13]。
　　2.1.2.2 生物导弹: 用特异性抗体(如抗P-gp单抗)联接上细胞毒素或抗癌药物, 定向、选择性地杀灭耐药细胞 [13,19]；用抗P170蛋白等的特异性抗体和含抗癌药物的脂质体制备成特异性免疫脂质体，可特异地导向过度表达P170等膜糖蛋白的耐药细胞，提高脂质体的靶向性，发挥抗体的特异封闭和脂质体减少药物与药泵的接触机会的双重作用，特异性地抑制耐药细胞内药物的外排。
　　2.1.2.3 肿瘤杀伤效应细胞: LAK细胞、CD3AK细胞、特异性CTL细胞等肿瘤杀伤效应细胞, 对耐药白血病细胞有较高的杀伤活性。因此, 过继免疫治疗和化疗的联合治疗可能有助于克服白血病多药耐药 [18]。
　　2.1.3 基因治疗
　　2.1.3.1 反义核酸: 体外合成针对MDR-1 DNA或mRNA特定序列的反义DNA、反义RNA或肽核酸(PNA)可与耐药白血病细胞MDR-1 DNA或mRNA 的特定序列互补杂交结合，抑制其转录和翻译, 达到封闭MDR-1基因表达的目的; 或通过体外基因重组, 将编码MDR-1 mRNA反义RNA的反义基因转导入肿瘤细胞, 合成内源性反义RNA, 封闭MDR-1 mRNA的表达 [14]。
　　2.1.3.2核酶: 设计合成针对MDR-1 mRNA特定序列的核酶, 处理耐药细胞, 或用核酶基因直接转染耐药细胞，产生细胞内特异性核酶，在特定位点选择性切割、降解MDR-1 mRNA, 阻止P-gp的合成而逆转耐药 [15]。
　　2.1.3.3化疗药物基因治疗：将基因治疗和化疗药物结合起来的治疗方法，主要有药物敏感基因治疗(亦称自杀基因治疗)和药物增敏基因治疗两类。① 自杀基因治疗是向肿瘤细胞内导入可编码特定酶类(药物前体转换酶)的基因，该基因的表达产物—酶可将对细胞无毒或低毒的药物前体转变为抗癌细胞毒药物，选择性地使转有该基因的肿瘤细胞自杀，而不伤及正常细胞。如果某些肿瘤细胞对某个药物耐药，亦可考虑向耐药细胞内导入自杀基因，应用该药的前体，经转换酶的作用在肿瘤细胞局部或内部转化为高浓度的细胞毒药物，提高对耐药肿瘤细胞的杀伤活性，例如DC/5-FC—5-FU。② 药物增敏基因治疗是设想将能增加化疗药物敏感性的基因转导入肿瘤细胞，使其对某类抗癌药物的敏感性增强，提高耐药细胞对化疗药物的敏感性。目前发现钙调素(calmodulin, CaM)基因能促进肿瘤细胞对长春新碱或长春花碱的敏感性，逆转肿瘤细胞的耐药性，其原理是CaM基因的表达产物作为细胞内信号传导系统的重要物质可明显增加细胞对长春新碱或长春花碱的的吸收而减少其排泄量。从而提高了胞内药物浓度，导致细胞死亡。
　　2.2 促凋亡策略
　　目前认为白血病细胞耐药的另一原因是凋亡的抑制。因此, 采用适当的方法促进或诱发耐药细胞凋亡, 或抑制凋亡调控基因的异常表达, 是克服白血病 (肿瘤)细胞耐药的又一重要策略。但由于对细胞凋亡发生的确切机制，以及耐药与凋亡的确切关系尚不完全了解, 故此领域的研究较少。
　　2.2.1 促凋亡物质: 耐药白血病细胞存在凋亡的抑制, 但绝大多数常用的化疗药物对促进 白血病耐药细胞凋亡几乎无效，因此逆转 白血病耐药细胞的凋亡抑制, 应着眼于非细胞毒类物质。研究发现, GM-CSF可激活凋亡过程而促进阿糖胞苷(Ara-C)的作用; 全反式维甲酸、砷剂可降低耐药细胞bcl-2、bcl-XL 等基因的表达, 促进化疗药物诱发的白血病细胞的凋亡。米托蒽醌抑制 c-myc和bcl-2基因的表达而促进耐药细胞凋亡; 紫杉醇可激活Raf-1蛋白，使P26-bcl-2蛋白磷酸化而失活, 丧失增强细胞生存的作用 [10,12]。
　　2.2.2    生物治疗: ① 抗体: 细胞凋亡抑制基因bcl-2、C-erbB-2/neu等编码产物(P26-bcl-2、P185等)的特异抗体, 可特异性地灭活或封闭其基因产物，从而逆转耐药细胞凋亡的抑制; 其中抗P185 蛋白的抗体已应用于临床治疗; ② 反义核酸: 针对bcl-2 基因及其表达产物的反义RNA抑制bcl-2基因的的表达, 可增加耐药白血病细胞对凋亡的敏感性, 促进耐药细胞凋亡[10]; 向P53基因表达异常的耐药细胞转导野生型P53基因, 也可促进耐药细胞对化疗药物的敏感性而凋亡；K562细胞中融合基因bcr/abl的表达产物可抑制细胞凋亡, 从而耐受抗癌药物和