PCR技术在血友病A中的应用

血友病 A 是常见的遗传性凝血障碍，它是由凝血因子 Ⅷ 的基因缺陷而致其功能异 常的致其发病率改为 1/1000 男性，女性患者极为少见 . 在临床上，血友病大都有家族 史，亦有约 20 ～ 30% 的患者为散发病例，为新生基因突变所致 .
一、血友病的遗传学
　　本病为 X 连锁隐性遗传病，其基因定痊于 Xq28. 因子 Ⅷ (FV Ⅲ ) 基因全长约为 186Kb ， 包括 26 个外显子和 25 个内含子，其 mRNA 全长约为 9Kb ， CDNA 占为 9009bp. 其翻译产物为 2351 个 aa 残基的多肽链 . 在 FV Ⅲ 基因内含有多个酶切位点，在其翻译区尚有 VNTR 序列 及 (CA/n 重复序列 .
二、 FV Ⅲ 基因突变的特点
　　 ( 一 ) 大范围的缺失，重排，重复及括入仅点血友病 A 的 5%
　　 ( 二 )FV Ⅲ 基因突变的主要类型为单碱置换所引起的点突变，目前还发现的单碱是 置及在八十种以上，几乎涉及 FV Ⅲ 的所有外显子和部分内含子 .
三、 PCR 技术在血友病 A 基因产前诊断中的应用
　　 FV Ⅲ 基因突变以点突变为主，而且有高度异质性，因此对患者的诊断 10 前还是主 要依据临床表现进行，在一个家系内若要进行血友病 A 的产前诊断，则必须用连锁分 析的方法，该方法的应用则必须满折方法有以下两种 :
( 一 ).PCR-RFLP
　　在因子组基因内及其复侧有多组 RFLP 位点可用为标记进行连锁分析进行产前诊 断，常用的 PCR-RFLP 位点有两种，其引物序列，酶切片段多者情况见下表 .
位点 引物序列 内切酶 长度 酶解片段
Ext18 5'-TAAAAGCTTAAATGG TCTAGGC-3' Bcl Ⅰ 142 99 ＋ 43
　 5'-TTCGAATTCTGAAATT ATCTTGTTC-3' 　　 　 　
Int22 5'-CACGAGCTCTCCATCT GAACATG-3' Xba Ⅰ 96.0 68 ＋ 28
　 5'-GGGCTGCAGGGGGGG GGGACAACAG-3' 　 　 　
Int19 5'-GGCGAGCATCTACAT GCTGGGATGAGC-3' Hind Ⅲ 717 469 ＋ 167 ＋ 81
　 5'-GTCCAGAAGCCATTC CCAGGGGAGTCT-3' 　 　 　
( 二 ) ， Amp-FLP
　　在 FV Ⅲ 区内尚有两个 VNTP 区，一个位于 DXS52 ，另一个为 (CA)n 位于 DX102 内，它 仍均具有复杂的多者性，亦可用于连锁分析，是引物及扩增产物的多者性见下表
位置 引物 片段 范围
DXS52 5'GGCATGTCATCACTTCT CTCATGTT-3' 14 0.7-3.0
　 5'CACCACTGCCCTCACG TCACTT-3' 　 　
DX102 5'GTAGTCTCAGTCGACA TGCTTTGAC3' 8 152±
　 5'GCTGAGAAAGTAGATC CTAAGTGTTC3' 　　 　
( 三 ) 血友病 APCR 基因诊断程序
　　 1. 母亲、先证者的 RFLP 及 Amp-FLP ，确定风险染色体
　　 2. 检测胎儿性别 (SRT) 　　
3. 检测胎儿的 RFLP 及 AmP-FLP
四、散发病例 FV Ⅲ 基因突变的 PCR 检测
　　由于因子 FV Ⅲ 的基因突变以点突变为主，而且具有高度特异性，因此，单独网点 突变的检测方法仍以诊断，对于形发病例来说，可用 PCR-SSCP ， PCR-DGGE 及其它的点 突变是筛查方法确定点突变血友病 A 之间的关系具有重要意义，尤其是 PCR-DGGE 已用 于血友病 A 基因点突变的筛查。

            虽然目前治疗血友病尚无特效药治疗，但我院应用中药治疗本病取得了一定的效果，可使部分患者出血症状减轻，提高生存质量。